William Erwin Eisner blev født af jødiske emigranter og voksede op i New York-bydelen Brooklyn. Moderen var rumæner og hjemmegående husmoder, og faderen var østriger med arbejde som kulissemaler i et jødisk teater. Børskrakket i 1929 og de efterfølgende depressionsår ruinerede familien, og Eisner måtte som dreng tage job som avissælger. I “Spirit 14” citeres han for, at “det var på det tidspunkt, jeg for alvor begyndte at interessere mig for tegneserier. Alle de store tegnere var i de aviser, jeg solgte”.
Familien flyttede til en lejekaserne i Bronx, hvor de levede under trange kår. Will Eisner fik som 16-årig publiceret sin første tegning, en illustration til en artikel med titlen “The Forgotten Ghetto” om fattigdommen i Bronx til sin high school-avis. Efter skolen arbejdede han som reklametegner og illustrator på forskellige aviser og begyndte i 1935 at lave udkast til sine første, professionelle tegneserier. Debuten kom året efter i David McKay Publications' “Wow, What a Magazine!”, men bladet stoppede efter kun fire numre. Eisner startede i 1937 sammen med Samuel “Jerry” Iger tegnestuen Eisner-Iger Shop for at levere tegneserier til det hastigt voksende hæftemarked.
I 1939 fik Eisner et tilbud fra forlaget Quality Comics Group, som gik ud på at udvikle et 16 siders tegneserietillæg i hæfteformat til avisernes weekendudgave. Han trådte derfor ud af samarbejdet med Iger for at koncentrere sig om denne opgave. Det første hæfte med Eisners nye serie “The Spirit” kunne første gang læses i 1940. Det blev udgivet i næsten 5 millioner eksemplarer i over tyve forskellige aviser. Efter Amerikas indtræden i 2. Verdenskrig blev Eisner indkaldt til hæren i 1942. Militærtiden gav ham imidlertid mulighed for at fortsætte som tegner. Eisner fik en hel del illustrationsopgaver for Pentagon, og han producerede en lang række illustrerede manualer til brug ved vedligeholdelsen af militært materiel.
Efter krigens afslutning i 1945 vendte Eisner tilbage til “The Spirit”, og i 1948 startede han sit studio, American Visuals, med det formål først og fremmest at producere tegneserier til undervisning og reklame. Eisner giftede sig i 1950 med Ann Louise Weingarten, og samme år begyndte American Visuals at arbejde for den amerikanske hær. De producerede blandt andet instruktionsmagasinet P.S. med den lidt tumpede Joe Dope som gennemgående figur. På grund af arbejdet med American Visuals stoppede Eisner Spirit-serien i 1952, og i de næste 25 år holdt han sig stort set væk fra den offentlige tegneseriescene.
I 1974 begyndte Eisner at undervise på School of Visual Art i New York, og i midten af 1970'erne leverede han igen bidrag til det etablerede tegneseriemarked i form af en stribe satiriske tegneserier i bogform, der tog forskellige emner som astrologi og forældre under kærlig behandling. I 1978 introducerede han med udgivelsen af “A Contract With God” et nyt begreb inden for tegneseriemediet i amerika: graphic novels. Denne nye genre udviklede han i de følgende år i en lang række banebrydende værker.
Eisner nedskrev i 1985 sine erfaringer indhentet gennem 50 års arbejde med tegneserier i bogen “Comics & Sequential Art”, og de er delvist bygget over hans forelæsninger fra School of Visual Art. I 1987 indstiftes The Eisner Award, den amerikanske tegneseriebranches svar på en Oscar.
Eisner stoppede med at undervise på School of Visual Art i 1993, da han flyttede til Florida med sin kone. Han fortsatte dog med at producere grafiske romaner af høj kvalitet helt op til 2005, hvor han dør efter en by-pass operation.