Gertrude Stein blev født som det yngste barn i en amerikansk børneflok på fem i 1874. Kort tid efter rejste familien til Europa, og de første seks år af Steins liv boede de i Wien og Paris. Herefter flyttede familien til Californien. Med få års mellemrum døde først Steins mor og siden hen faren. Storebroren Michael investerede familiens penge hensigtsmæssigt, hvilket gjorde, at Gertrude Stein var økonomisk sikret resten af sit liv. Hun påbegyndte medicinstudiet på Johns Hopkins Medical School i Baltimore og publicerede to videnskabelige artikler, inden hun i 1901 droppede ud og flyttede med broren Leo til Paris. Her blev hun boende frem til sin død i 1946.
I Paris gik de to søskende på gallerier og forelskede sig i den avantgardistiske kunst, der udfordrede publikums kunstforståelse. I 1919 skrev Stein debuten ”Three Lives”, men størstedelen af sin omfangsrige, litterære produktion kunne hun hverken finde forlæggere eller læsere til. Eksempelvis forblev den næsten 1000 sider lange ”The Making of Americans”, som hun skrev på fra 1903 til 1911, uudgivet i mange år. Bogen begyndte som en beskrivelse af Steins egen tysk-jødiske families ankomst til Amerika, men udviklede sig til et omfangsrigt katalog over mulige liv.
I september 1907 mødte Stein den amerikanske kvinde Alice B. Toklas i Paris. De to blev partnere og boede sammen i lejligheden på 27 rue de Fleurus, hvor de sagnomspundne saloner fandt sted. Toklas virkede som sekretær, kok og muse for Stein. Hun lagde også navn til Steins første publikumssucces, erindringsbogen ”The Autobiography of Alice B. Toklas” (”Alice B. Toklas’ selvbiografi”, 1982). Da denne udkom, takkede Stein ja til at tage på foredragsturné i hjemlandet USA, hvor hun bl.a. talte på flere universiteter om sit forhold til komposition, grammatik og det at skrive portrætter. Det mest kendte portræt af Stein selv er malet af vennen og billedkunstneren Pablo Picasso. I brune nuancer og kubistisk stil sidder Stein tænksom i en lænestol. Picasso var en af de mange kunstnere, forfattere og dansere, som kom i Steins hjem. Flere af de malerier som Stein købte, f.eks. af Henri Matisse og Paul Cézanne, er senere blevet kunsthistoriske klassikere. Af de forfattere, som frekventerede Steins saloner efter Første Verdenskrig, kan nævnes Ernest Hemingway, T.S. Eliot og F. Scott Fitzgerald. Denne gruppe af unge forfattere døbte Stein den fortabte generation. Betegnelsen er, som Stein selv, senere gået over i litteraturhistorien.