Karen Christentze Dinesen blev født den 17. april 1885 på gården Rungstedlund i Nordsjælland som andet barn ud af fem af forældrene Wilhelm og Ingeborg Dinesen. Hun voksede op i et privilegeret hjem, hvor børnene ikke gik i skole, men fik privatundervisning i hjemmet.
Allerede som barn var Karen optaget af kunst og litteratur. Hun tegnede, malede og skrev historier, som hun læste på sengekanten for sin søster Ellen, og nogle af historierne fandt også vej til stuen, hvor de blev læst højt eller opført som skuespil. Men der var også skygger over barndommens land. Faren led af posttraumatisk stress efter at have deltaget i de dansk-tyske krige, bl.a. Slaget ved Dannevirke og Dybbøl. Da Karen var 10 år, hængte han sig.
Som ung drømte Karen om at blive kunstmaler, og i 1902 blev hun optaget på Charlotte Sodes tegneskole, og året efter kom hun på Kunstakademiet. Men litteraturen trak også, og i 1907 debuterede hun med fortællingen ”Eneboerne” under pseudonymet Osceola i magasinet Tilskueren. Da debuten ikke kastede nogen glans af sig, sad Karen tilbage med en følelse af ikke rigtig at være lykkedes. Heller ikke i kærlighedslivet. Hun var ulykkeligt forelsket i sin svenske halvfætter Hans von Blixen-Finecke, men det endte med, at det blev hans bror, baron Bror von Blixen-Finecke, hun giftede sig med i 1914. Bror Blixen var hverken særligt litterær eller intellektuel, men var fuld af handlekraft, og Karen og Bror fandt sammen om drømmen om et stort eventyr. De købte en kaffefarm ved Ngong Hills i Kenya (dengang Britisk Østafrika), og selv om hverken ægteskabet eller kaffefarmen blev den store succes, kom årene i Afrika til at forme Karen Blixens liv og forfatterskab.
I 1925 blev ægteparret skilt. Karen drev farmen videre, til den gik konkurs i 1931, og Karen forlod Afrika for altid. Hjemme i Danmark kæmpede hun for at finde sin retning i livet. Hun sørgede over tabet af kaffefarmen og over at have mistet sit livs kærlighed, Denys Finch Hatton – en engelsk adelsmand, som hun havde haft et forhold til i Afrika, men som var død i en flyulykke, kort inden hun rejste hjem.
Som 48-årig debuterede Karen Blixen i USA under pseudonymet Isak Dinesen med novellesamlingen ”Seven Gothic Tales” (”Syv fantastiske fortællinger”). Fortællingerne blev en bragende succes på det amerikanske marked og startskuddet til et af dansk litteraturs mest markante forfatterskaber.
I 1962 døde Karen Blixen på Rungstedlund, 77 år gammel, efter mange års sygdom, der i lange perioder havde lænket hende til sengen.